شناسايي مولكولي گونه‌هاي ريزوباكتري باسيلوس محرك رشد گياه (PGPR)

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي كشاورزي

كارشناسي ارشد

ريزوباكتري‌هاي محرك رشد گياه (PGPR) به عنوان عوامل زيستي كليدي در كشاورزي پايدار، نقش محوري در افزايش جذب مواد مغذي، توليد فيتوهورمون‌ها، سركوب پاتوژن‌ها و القاي مقاومت سيستميك ايفا مي‌كنند. اين پژوهش با هدف شناسايي مولكولي گونه‌هاي منتخب جنس Bacillus شامل B. amyloliquefaciens، B. megaterium و B. pumilus از خاك ريزوسفر گياه گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) تيمارشده با باكتري هاي مذكور، انجام شد. توالي ژن‌هاي 16S rRNA و 23S rRNA از پايگاه NCBI دريافت شد و پس از هم‌ترازسازي با نرم‌افزار MEGA11 و الگوريتم ClustalW، آغازگرهاي اختصاصي گونه‌محور BA23، BM23 و BP23 بر اساس نواحي متغير ژن 23S rRNA طراحي گرديد. اختصاصي بودن آغازگرها با ابزارهاي Oligo7، Oligo Analyzer و Primer-BLAST ارزيابي شد. نمونه‌برداري از خاك ريزوسفر در عمق 15-10 سانتي‌متري انجام شد و باكتري‌ها با رقيق‌سازي سريالي و كشت در محيط Nutrient Agar جداسازي شدند. استخراج DNA ژنومي با پروتكل CTAB-فنول-كلروفرم بهينه‌سازي شد و كيفيت آن با الكتروفورز ژل آگارز %7/0 تأييد شد. واكنش PCR با شيب دمايي 61-51 درجه‌ي سلسيوس براي تعيين دماي اتصال بهينه اجرا شد و در نهايت محصولات با روش Sanger توالي‌يابي گرديدند. تحليل فيلوژنتيك با روش Maximum Likelihood و پارامترهاي حذف جزئي انجام گرفت و گونه P. libanensis به عنوان گروه خارجي استفاده شد. نتايج نشان داد كه آغازگرهاي طراحي‌شده قطعات مورد انتظار (حدود 600-900 جفت‌باز) را به صورت اختصاصي تكثير كردند و واكنش متقاطع با DNAهاي غير هدف نداشتند. درخت فيلوژنتيك نزديكي گونه‌هاي B. amyloliquefaciens و B. subtilis را با تشابه بيش از %4/99 نشان داد، در حالي كه فاصله ژنتيكي با P. libanensis بيش از %22 بود. تحليل BLASTn همساني بيش از %99، پوشش %100 و E-value صفر را براي گونه‌هاي هدف تأييد كرد. با اين حال، چالش‌هايي مانند ناهمخواني در شناسايي B. megaterium به دليل همساني ژنتيكي بالا در كمپلكس گونه‌اي Bacillus مشاهده شد، كه محدوديت‌هاي روش‌هاي مبتني بر rRNA را برجسته مي‌سازد. اين پژوهش ابزارهاي مولكولي كارآمدي براي شناسايي سريع PGPRها ارائه داد كه پتانسيل كاربرد در توليد كودهاي زيستي و كنترل بيولوژيكي را دارد. يافته‌ها بر لزوم تركيب نشانگرهاي مكمل مانند gyrB براي غلبه بر محدوديت‌هاي تاكسونوميك تأكيد مي‌كنند و پيشنهاد مي‌شود تحقيقات آينده بر توسعه سيستم‌هاي Multiplex PCR و ارزيابي تأثير تغييرات اقليمي بر جمعيت Bacillus تمركز يابند.

235596

بيوتكنولوژي كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان