توليد و خالص سازي شكل نوتركيب آنزيم T7RNA پليمراز در باكتري اشريشياكلي

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

بيوتكنولوژي كشاورزي

كارشناسي ارشد

اين پژوهش با هدف توليد و بهينه‌سازي فرم نوتركيب آنزيم T7 RNA پليمراز (T7RNAP) به‌عنوان يكي از ابزارهاي كليدي در زيست‌فناوري مدرن انجام شد. اين آنزيم به‌طور گسترده در سنتز RNA، توسعه واكسن‌هاي mRNA، سامانه‌هاي بيان پروتئين و مطالعات بيولوژي مولكولي كاربرد دارد. محدوديت‌هاي موجود در دسترسي به آنزيم تجاري در كشور، هزينه‌هاي بالا و وجود ناخالصي‌هايي نظير گليسرول كه بر كارايي سامانه‌هاي بدون سلول تأثير منفي مي‌گذارد، ضرورت توليد نسخه بومي و مقرون‌به‌صرفه اين آنزيم را دوچندان مي‌كند. در اين تحقيق، ابتدا ژن كدكننده T7RNAP از فاژ T7 در وكتورهاي pAK-T7RNAP و pET28a-T7RNAP همسانه‌سازي و به سويه‌هاي مختلف E. coli (DH5α براي تكثير پلاسميد و BL21 براي بيان پروتئين) منتقل شد. به‌منظور افزايش بازده توليد، بيان آنزيم در شرايط مختلف از جمله دماهاي متفاوت (37 و 20 درجه سانتي‌گراد) بررسي گرديد. نتايج نشان داد كه كاهش دما به 20 درجه سانتي‌گراد نه‌تنها پايداري و حلاليت پروتئين را افزايش داد، بلكه امكان توليد مقادير بيشتري از پروتئين نوتركيب محلول را فراهم كرد. خالص‌سازي پروتئين از طريق سيستم‌هاي مبتني بر برچسب هيستيديني و كروماتوگرافي موفقيت‌آميز بوده و غلظت نهايي پروتئين خالص به حدود 7 ميلي‌گرم از 80 ميلي‌ليتر محيط كشت رسيد كه بيانگر ظرفيت توليد در مقياس صنعتي است. براي بررسي عملكرد، آنزيم نوتركيب در واكنش‌هاي رونويسي آزمايشگاهي مورد آزمون قرار گرفت. نتايج نشان داد كه اين آنزيم فعاليتي قابل‌مقايسه با نمونه‌هاي تجاري دارد و RNA با طول مورد نظر را با دقت بالا سنتز مي‌كند. يكي از يافته‌هاي مهم، عدم تشكيل محصولات RNA غير اختصاصي بود؛ مشكلي كه در آنزيم‌هاي تجاري به‌ويژه به‌دليل حضور گليسرول بالا مشاهده مي‌شود. بررسي‌هاي تكميلي نشان داد كه افزودن گليسرول در غلظت‌هاي بيش از 10٪ مي‌تواند باعث توليد RNAهاي ناخواسته و كاهش كيفيت محصول گردد. همچنين، استفاده از DNA حلقوي نسبت به DNA خطي بازده بالاتري در سنتز RNA داشت كه مي‌تواند راهبردي مؤثر در طراحي الگوهاي آينده باشد. يافته‌هاي اين پژوهش تأييد مي‌كند كه توليد آنزيم T7RNAP در كشور امكان‌پذير است و آنزيم حاصل از لحاظ خلوص، كارايي و قابليت استفاده در سامانه‌هاي Cell-free پروتئين، برتر از نمونه‌هاي وارداتي حاوي گليسرول عمل مي‌كند. اهميت اين نتيجه در كاهش هزينه‌ها، استقلال علمي و صنعتي، و فراهم‌سازي زيرساختي پايدار براي توسعه فناوري‌هاي نوين همچون واكسن‌هاي mRNA، درمان‌هاي مبتني بر RNA و نانوزيست‌فناوري برجسته است. به‌طور كلي، اين تحقيق نه‌تنها يك مسير عملي براي توليد آنزيم‌هاي كليدي زيست‌فناوري را ارائه مي‌دهد، بلكه زمينه‌ساز توسعه روش‌هاي نوآورانه در بيان پروتئين، سنتز RNA و كاربردهاي درماني آينده خواهد بود. نتايج به‌دست‌آمده ظرفيت بالاي اين آنزيم را در پاسخ‌گويي به نيازهاي پژوهشي و صنعتي كشور نشان مي‌دهد و مي‌تواند بستري براي توليد كيت‌ها و فرآورده‌هاي مبتني بر RNA در مقياس ملي فراهم سازد.

236343

بيوتكنولوژي كشاورزي

مهندسي كشاورزي

دانشگاه صنعتي اصفهان