عنوان
بررسي اثرات سايتوتوكسيك هارمين در حضور حذف همزمان ژن ANRIL بر فرآيندهاي پيري سلولي، آپوپتوز و تومورزايي در رده ي سلولي A549 سرطان سلول غيركوچك ريه (NSCLC)
نويسنده اصلي
شريفي، عرفان
محل تحصيل
دانشگاه علوم پزشكي كردستان
رشته تحصيلي
پزشكي مولكولي
چكيده
زمينه و هدف: سرطان ريه دومين سرطان شايع و اولين عامل مرگ‌ومير ناشي از سرطان در هر دو جنس است. اين بيماري معمولاً با جهش‌هايي در TP53، حذف در ناحيه INK4-ARF و جهش KRAS همراه است. هارمين، يك تركيب β-carboline مشتق از گياه اسپند، فعاليت ضدسرطاني خود را در انواع مختلف سرطان‌ها، از جمله سرطان ريه، نشان داده است. در اين مطالعه اثرات هارمين در دو رده سلولي سرطان سلول غيركوچك ريه با جهش KRAS بررسي شد: رده سلولي Calu-6 كه داراي P53 غيرفعال و ناحيه INK4-ARF بدون جهش است و رده سلولي A549 كه داراي P53 نوع وحشي و ناحيه INK4-ARF حذف‌شده مي¬باشد. علاوه بر اين، ANRIL، يك RNA غيركدكننده طويل كه ژن‌هاي سركوبگر تومور لوكوس INK4-ARF را سركوب مي‌كند، با استفاده از تكنيكCRISPR/Cas9 در سلول‌هاي Calu-6 ناك¬اوت شد تا نقش آن به¬صورت مستقل و همچنين در اثرات القا شده توسط هارمين ارزيابي گردد.
مواد و روش‌ها: اين مطالعه در چهار فاز مجزا صورت گرفت. در فاز اول وضعيت لوكوس INK4-ARF در دو رده سلولي A549 و Calu-6 با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و PCR استاندارد مورد بررسي قرار گرفت. در فاز دوم آماده¬سازي وكتور PX459 V2 و كلون كردن sgRNA¬¬ها جهت حذف ژن ANRIL انجام شد. در فاز سوم توليد رده سلولي Calu-6 داراي حذف در ژن ANRIL با استفاده از وكتور آماده شده در فاز دوم صورت پذيرفت و در نهايت در فاز چهارم اين مطالعه، پاسخ سلول‌ها به درمان با هارمين با استفاده از آزمون MTT براي ارزيابي تغييرات در بقاي سلولي، آزمون تشكيل كلوني براي ارزيابي تكثير سلولي و رنگ‌آميزي Annexin V/PI و فلوسايتومتري به¬منظور آناليز آپوپتوز و توزيع چرخه سلولي، انجام شد. علاوه بر اين، بيان پنلي از ژن‌هاي منتخب جهت بررسي مكانيسم‌هاي مولكولي احتمالي در ايجاد تغييرات فنوتيپي سلول‌هاي تيمار شده با هارمين مورد بررسي قرار گرفت.
يافته¬ها: مشاهدات ما نشان مي‌دهند كه هارمين بقاي سلولي و تكثير را در تمامي رده¬هاي سلولي بررسي‌شده كاهش داده و منجر به القاي آپوپتوز در آنها شده است. اثرات هارمين در سلول‌هاي Calu-6 با حذف ANRIL برجسته‌تر از ديگر سلول¬ها بود، كه نشان مي‌دهد ANRIL در حساسيت سلول‌ها به هارمين و افزايش سيتوتوكسيسيتي القا شده توسط هارمين نقش دارد. تحليل چرخه سلولي نشان داد كه درمان با هارمين منجر به كاهش تعداد سلول‌هاي فاز G0/G1، توقف در فاز G2/M و افزايش تعداد سلول‌هاي آپوپتوتيك Sub-G1 در هر دو رده سلولي A549 و Calu-6 شد. در مقابل، حذف ANRIL به تنهايي منجر به تجمع سلول‌ها در فاز G0/G1 شد. با اين حال، در اين سلول‌ها، پس از درمان با هارمين، جمعيت سلول‌هاي فاز G0/G1 كاهش يافته و توقف چرخه سلولي به فاز G2/M تغيير پيدا كرد. تحليل بيان ژن‌ها نشان داد كه درمان با هارمين در سلول‌هاي A549 باعث افزايش پايداري و فعاليت رونويسي P53 از طريق HIPK2 مي‌شود، كه اين امر منجر به فعال‌سازي مسير P53 و افزايش بيان ژن‌هاي سركوبگر تومور P21 و P27، فاكتورهاي پيش¬آپوپتوزي BAX و CASPASE-3 و كاهش بيان SKP2 و BCL-2 مي‌شود و در نهايت آپوپتوز را القا مي‌كند. در سلول‌هاي Calu-6 كه فاقد P53 فعال هستند، همولوگ آنها، p73، فعاليت P53 را جبران مي‌كند. پس از درمان با هارمين،p14ARF و HIPK2 به طور هم‌افزا p73 را تثبيت و فعال مي‌كنند. علاوه بر اين، حذف ANRIL اين تغييرات در بيان ژن‌ها را تشديد كرده و باعث تقويت سميت سلولي القا شده توسط هارمين مي‌شود.
نتيجه‌گيري: تمام يافته‌ها نشان مي‌دهند كه تركيب درمان با هارمين همراه با استراتژي‌هاي هدف‌گيري ANRIL مي‌تواند يك رويكرد نوين و مؤثر براي درمان سرطان ريه ارائه دهد.
كليد واژه¬ها: سرطان سلول غيركوچك ريه؛ هارمين؛ LncRNA ANRIL؛ P53 ؛ لوكوس INK4-ARF؛ پيري سلولي؛ سكون سلولي؛ CRISPR/Cas9
شماره ركورد
237406
شهر محل تحصيل
دانشگاه علوم پزشكي كردستان
گرايش رشته تحصيلي
پزشكي مولكولي
دانشكده
پزشكي
دانشگاه
دانشگاه علوم پزشكي كردستان
استاد راهنما
ذكريا وهاب زاده ، فردين فتحي