ارزيابي پايداري حرارتي آنزيم كيوتيناز براي هيدروليز آنزيمي پلياستر با استفاده از جهشزايي هدايت يافتة مكاني

اصفهان : دانشگاه صنعتي اصفهان

مهندسي نساجي

دكتري

باتوجه‌ به مصرف روزافزون پلياستر در صنايع مختلف ازجمله صنعت نساجي و نگرانيهاي گستردهي جهاني پيرامون زيستتخريب ناپذيري اين پليمر، رويكرد اين پژوهش مهندسي نوعي آنزيم استر هيدرولاز از خانوادة كيوتينازها موسوم به LCC باهدف افزايش پايداري حرارتي آن و امكانسنجي استفاده از آن براي هيدروليز سطحي و يا تخريب پلياستر بود. در اين راستا در ابتدا با استفاده از روش داكينگ مولكولي و مولكول C9C ساختار آنزيم/سوبسترا تهيه شد و سپس توسط شبيهسازي ديناميك مولكولي (MD) و آناليز نتايج RMSD و RMSF آمينواسيدهاي كليدي كه در دماي نزديك به دماي انتقال شيشهاي پلياستر بيشترين تأثير را بر ناپايداري حرارتي آنزيم داشتند شناسايي شدند. در نتيجهي اين بررسيها و همترازي توالي نوكلئوتيدي با توالي همولوگ‌هاي اين آنزيم، آمينواسيدهاي T60 موجود در صفحهي β_1 و N122 موجود در حلقهي متصلكنندهي β_4-α_3 به ترتيب با لايزين و ايزولوسين جايگزين شدند. در ادامه مجددا ساختار آنزيم موتانتKI /C9C توسط روش داكينگ مولكولي تهيه شده و تاثير جهشهاي ايجاد شده بر كل پروتئين و بر تكتك آمينواسيدها توسط شبيه سازي ديناميك مولكولي بررسي شد. نتايج نشاندهندهي كاهش RMSD و RMSF در برخي قسمتها بهويژه در نواحي جهش دادهشده بود. سپس توالي نوكلئوتيدي آنزيم اصلاح شده طراحي شده و براي سنتز ارسال شد. آناليز توالييابي سنگر و الكتروفورز ژل آگارز گوياي سنتز صحيح توالي بودند. در ادامه توالي نوكلئوتيدي مذكور به همراه LCC توسط وكتور بياني pET 26b(+) طي فرآيند كلونينگ در باكتري E.Coli BL21 (DE3) بيان و توسط روش IMAC خالصسازي شدند. پس از آن فعاليت 500 ميكروليتر از آنزيمها در 55 درجهسانتيگراد اندازهگيري شد كه به ترتيب µmol/L.min 281/4 و µmol/L.min 014/4 بودند. بررسي دما و pH بهينهي عملكرد آنزيمها توسط سوبستراي مايع پارانيتروفنيل بوتيرات انجام شد. نتايج نشان داد دماي بهينهي عملكرد آنزيم پس از جهش ايجادشده با افزايش 10درجهاي از 55 درجهسانتيگراد به 65 درجهسانتيگراد رسيد درحاليكه pH بهينه براي هر دو آنزيم 8 بود. به علاوه، آنزيم موتانت در دماهاي بالاتر از 70 درجهسانتيگراد نيز به ميزان 5/1 برابر فعاليت بالاتري نسبت به LCC نشان داد. بررسي شاخصهاي سينتيكي V_max و K_m كه به ترتيب براي LCC و KI، µg/ml.min 49/6 و 43/8 و mM 28/0 و 26/0 بودند نشان‌دهنده‌ي عدم تغيير افينتيه آنزيم نسبت به سوبسترا و افزايش سينتيك واكنش بود. در نهايت عملكرد آنزيمها بر سه نوع سوبستراي پلي‌استري شامل فيلم پلي‌استر آمورف (با درجه كريستالينيتي 7%)، نانوالياف پلي كاپرولاكتون (PCL) و الياف پلي‌اتيلن‌ترفتالات با درجه كريستالينيتي 84/35 % بررسي شد. براساس نتايج به‌دست آمده، كاهش وزن فيلم‌ پلي‌استر تيمارشده با KI در 70 درجه‌سانتي‌گراد، 33/1 برابر LCC بود. نمونه‌هاي PCL نيز در توسط هر دو آنزيم دماي 50 درجهسانتيگراد تيمارشدند. بررسي مورفولوژي اين نمونه‌ها نشان‌دهنده‌ي ايجاد نايكنواخي و ناهمواري بيشتر در سطح نانوالياف در پي تيمار با آنزيم KI بود.كاهش وزن نانوالياف تيمارشده با KI نيز به ميزان 4% بيشتر از نانوالياف تيمار شده با LCC بود. زاويه تماس قطره نيز از 04/1± 4/82 در نمونه‌هاي شاهد PCL به 31/1± 6/43 در نانوالياف تيمارشده با LCC و به 57/1± 7/27 در نانوالياف تيمارشده با KI رسيد كه نشان‌دهنده‌ي بهبود عملكرد آنزيم پس از ايجاد جهش بود در افزايش آبدوستي سطح نانوالياف است. در ادامه، با توجه به بلورينگي بالاي الياف پلي‌استر، از پيش‌تيمار پلاسماي تخليه با سد دي‌الكتريك (DBD) استفاده شد. در اين راهكار، برخلاف پژوهش‌هاي مشابه، فرايند پيش‌تيمار پلاسمايي و سپس انكوباسيون در محلول آنزيمي، به 10 سيكل متوالي تقسيم شد تا در هر مرحله، سطح تازه‌تر و آماده‌تري براي تعامل با مولكول‌هاي آنزيم فراهم گردد. در اين رويكرد، از دو گاز فعال اكسيژن (PO2) و اوزون (PO3) استفاده شد. نتايج بررسي‌هاي مورفولوژي نشان داد كه آنزيم موتانت KI تأثير بيشتري در تغيير مورفولوژي سطح و ايجاد ناهمواري داشته است. بيشترين تغييرات سطحي در الياف پلي‌استري مشاهده شد كه پيش‌تيمار شده با PO3 و سپس با آنزيم KI تيمار شده بودند. همين تيمار كمترين زمان ترشوندگي را نيز به همراه داشت كه نسبت به نمونه شاهد 75٪ كاهش يافته بود. همچنين، كاهش وزن در الياف تيمارشده با آنزيم KI، 1٫5 برابر بيشتر از نمونه‌هاي تيمارشده با آنزيم LCC بود و در اين ميان، گاز اوزون حدود 1٫25 برابر مؤثرتر از اكسيژن عمل كردبررسي تغييرات شيميايي سطح با استفاده از طيف‌سنجي FTIR-ATR نشان‌دهنده كاهش شدت پيك كربونيل و افزايش پيك‌هاي مربوط به گروه هيدروكسيل در نواحي cm⁻¹ 1100 و cm⁻¹ 972 بود. ...

237627

شيمي نساجي و علوم الياف

مهندسي نساجي

دانشگاه صنعتي اصفهان