بررسي اثرات تخريب ژن MAGE-A11 و Survivin بر زنده ماني و آپوپتوزيس در رده‌ هاي سلولي PC3 (سرطان پروستات) با استفاده از سيستمCRISPR/Cas9 .

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

پزشكي مولكولي

مقدمه: سرطان پروستات شايع ترين سرطان بدخيم در ميان مردان بوده و بعد از سرطان ريه دومين علت مرگ و مير ناشي از انواع سرطان در ميان مردان است. درمان هاي استاندارد مانند محروميت از اندروژن (ADT) و شيمي درماني كه ممكن است موجب تسكين موقتي شوند اما درماني محسوب نمي شوند، عود و مقاومت در برابر درمان، گسترش تومور و متاستاز اتفاق مي افتد و اين چالش برانگيز است. بنابراين استفاده از روشهاي مولكولي براي شناسايي و تنظيم عملكرد مولكولهايي كه در پيشرفت سرطان نقش دارند ضروري است. هدف قرار دادن ملكولهايي كه در روند بقا، تكثير و رشد سلولي و مسيرهاي آپوپتوتيك در سلولهاي سرطاني نقش مهمي بر عهده دارند به نظر مي رسد روش مناسب براي استراتژي هاي درماني آينده باشد. در بين انواع مختلف آنتي ژنهاي مرتبط با سرطان پروستات، ژن Survivin و MAGE-A11 ماركرهاي تشخيصي بسيار مهمي بوده و ارتباط تنگاتنگي با پيشرفت سرطان و عود بيماري دارند. Survivin از خانواده پروتئينهاي مهار كننده آپوپتوز است و نقش مهمي را در آپوپتوز، تقسيم و تكثير سلولي ايفا مينمايد. MAGE-A11 يك انكوژن است كه بيان آن در سرطانهاي مختلف از جمله سرطان پروستات افزايش مي يابد و با پيش آگهي ضعيف، افزايش رشد تومور، متاستاز و مقاومت در برابر شيمي درماني همراه است. تا كنون در مورد برخي از سرطانها از جمله سرطان پروستات ناك دان اين ژنها توسط تكنيكهاي RNAi و miRNA صورت گرفته اما بررسي ناك آوت و تخريب آنها تا به حال بررسي نشده است. لذا، در اين مطالعه براي اولين بار تخريب Survivin و MAGE-A11 توسط سيستم نوكلئازي CRISPR/Cas9 در سرطان پروستات مطالعه شد و در ادامه مكانيسمهاي احتمالي در مهار رشد و پروليفراسيون سلولي با بررسي بيان ژنهاي مهم در اين مسير از جمله RRM2,FBXO5 مورد تحقيق و پژوهش قرار گرفت. روشها: ابتدا مراحل كلونينگ شامل آماده سازي پلاسميد و خطي سازي ان، طراحي sgRNA ها و الحاق sgRNA ها در پلاسميد انجام شد، سپس جهت ازياد و تكثير پلاسميد، ترانسفورماسيون در باكتري صورت گرفت، جهت شناسايي كلني هاي حاوي پلاسميد الحاق شده با اليگو كد كننده sgRNA، واكنش كلني PCR و جهت تاييد نهايي توالي يابي به روش سنگر انجام شد. رده سلولهاي سرطان پروستات (PC3) با پلاسميد حاوي sgRNA با استفاده از ليپوفكتامين ترانسفكت شدند. از وكتور بدون sgRNA به عنوان كنترل منفي (Scramble) استفاده شد. سطح بيان Survivin، MAGE-A11، ريبونوكلئوتيدردوكتاز زير واحد كوچك (RRM2) و (FBXO5) با استفاده از (RT-qPCR) اندازه گيري شد. تكثير سلولي و آپوپتوز به ترتيب با روش XTT و Annexin V-PE / 7-AAD مورد سنجش قرار گرفتند. يافته ها: نتايج مطالعه ي حاضر نشان داد كه هدفگيري ژن با استفاده از فن آوريCRISPR/Cas9 بسيـار خوب بوده و ژنها به طور كـارآرايي نـاك آوت شده اند. مقايسـه ي نتايج بيان ژنها با استفـاده از PCR-qRT نشان داد كه بيان ژن Mage-A11 و Survivin در گروههاي تست كاهش چشمگيري داشته و با گروه كنترل اختلاف معنادار دارد. تستهاي بررسي تكثير سلولي و آپوپتوز با استفاده از CCK-8 و فلوسايتومتري نيز مويد آن بودند كه در سلولهاي ناك اوت شده در مقايسه با گروه كنترل، ميزان مرگ و مير و آپوپتوز به طور معناداري افزايش يافته شده است .علاوه بر اين ناك اوت با سيستم CRISPR /Cas9 سطح بيان ژنهاي RRM2 و FBXO5 را بطور اختصاصي كاهش داد. نتيجه گيري: در مجموع، اين مطالعه بيان ميدارد كه استفاده از سيستم CRISPR براي تخريب ژن Mage-A11 و Survivin روشي نوين و سودمند جهت درمان تغييرات ژنتيكي مرتبط با سرطان پروستات در انسان ميباشد و ميتواند به عنوان مقدمه و سرنخي براي طراحي مطالعات بزرگتر و نهايتا كارآزمايي هاي باليني باشد. ناك اوت اين ژنها منجر به كاهش پروليفراسيون و رشد سلولي و القا آپوپتوز گرديد با توجه به نقش RRM2 و FBXO5 در پروليفراسيون سلولي، مكانيسم احتمالي در مهار رشد سلولي ميتواند ناشي از مهار بيان RRM2 و FBXO5 در سلولهاي ناك اوت شده باشد. كلمات كليدي: سرطان پروستات، آپوپتوز،CRISPR/Cas9 Mage-A11, Survivin,.

81809

دانشگاه علوم پزشكي كردستان

پزشكي مولكولي

پزشكي

دانشگاه علوم پزشکي کردستان

علي جليلي